观察炎症分子核因子(NF)－κB、骨桥蛋白(OPN)及自噬相关分子微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62在糖尿病肾病(DN)大鼠肾小管间质表达的改变及外源性NF－κB抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC)的干预作用。
24只雄性Sprague－Dawley大鼠，其中12只给予60 mg/kg链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射制作糖尿病模型，成模后分为DN组、DN＋ PDTC组(PDTC腹腔注射，100 mg·kg－1·d－1)各6只；另12只分为对照组及PDTC组，每组各6只。12周后检测血清肌酐(Scr)及24 h尿蛋白，处死大鼠，观察肾病理改变，免疫组化检测NF－κB p65、OPN表达水平，电镜观察自噬改变，Western印迹检测肾皮质NF－κB p65、p62、OPN、LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ及细胞核磷酸化NF－κB p65(p－NF－κB p65)表达改变。
各组大鼠Scr差异无统计学意义(P>0.05)。DN组、DN＋PDTC组尿蛋白水平明显高于其他两组(均P<0.01)，但DN＋PDTC组明显低于DN组(P<0.05)。DN组肾小管间质p65、OPN表达水平均明显高于对照组及PDTC组(均P<0.05)，肾皮质NF－κB p65、p62、OPN及核p－p65蛋白表达水平均高于对照组及PDTC组，LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值下降(均P<0.05)，而DN＋PDTC组较DN组有明显改善。电镜下，DN组肾小管上皮细胞自噬泡明显减少、线粒体损伤增加，细胞核凋亡有明显增加，DN＋PDTC组较DN组明显改善。相关性分析显示，肾皮质LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ与核p－p65、OPN表达呈负相关(r＝－0.45，P＝0.02；r＝－0.50，P＝0.01)，p62表达与核p－p65、OPN表达呈正相关(r＝0.33，P＝0.01；r＝0.41，P＝0.01)。
DN大鼠肾小管细胞炎症激活与自噬功能缺陷密切相关，PDTC可能通过阻断NF－κB活性而抑制炎症，增强小管细胞自噬能力，减轻小管间质损害。
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糖尿病肾病(DN)是影响糖尿病患者预后的最重要并发症之一，也是尿毒症透析患者的主要病因。研究DN的分子机制，对防治其发生及进展有重要意义。已经明确，肾小管间质损害是影响DN预后的重要因素，核因子(NF)－κB及其下游骨桥蛋白(OPN)等炎症因子的作用是肾小管细胞凋亡、转分化及细胞外基质增加、间质纤维化的重要原因[1,2,3]。
自噬是细胞在饥饿、能量缺乏等条件下的生理反应，可有效去除细胞内变性的细胞器及大分子物质并重新利用，以减少细胞能量损耗[4]。在炎症、肿瘤等病理条件下，增强的自噬活动可能是细胞抵抗有害刺激的重要武器[4,5]。但目前在DN肾小管间质损害研究中尚无关于NF－κB与自噬关系的报道。本研究拟通过动物实验，探讨NF－κB抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC)对DN大鼠肾小管间质损害及自噬活性的干预作用及机制。
24只6周龄清洁级Sprague－Dawley(SD)雄性大鼠，体重220 g左右，由中国医学科学院动物中心提供，于天津医科大学实验动物中心饲养，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供饲料。链脲佐菌素(STZ)、PDTC购自美国Sigma公司。兔抗OPN、微管相关蛋白1轻链3(LC3)多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，兔抗p62、NF－κB p65、磷酸化NF－κB p65(p－ NF－κB p65)单克隆抗体、甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)及TATA结合蛋白(TBP)多克隆抗体购于美国Cell Signaling公司，SABC试剂盒购于北京中杉金桥公司，化学发光试剂盒购自美国Millipore公司。
24只雄性SD大鼠，随机取12只给予60 mg/kg STZ一次性腹腔注射制作糖尿病模型，72 h后测血糖高于16.7 mmol/L即为成模，此模型4周后即出现蛋白尿，为1型糖尿病肾病模型[2]。糖尿病成模后随机分为糖尿病肾病(DN)组、PDTC组(腹腔注射PDTC，100 mg·kg－1·d－1)，每组6只；另12只随机分为对照组(不注射PDTC)和PDTC组(腹腔注射PDTC，100 mg·kg－1·d－1)，每组6只。
成模后第8、12周，留取大鼠血清，入代谢笼禁食禁水24 h留尿；测体重，血清肌酐(Scr)等生化指标。第12周取血留尿后处死大鼠，取肾并分离肾皮质待用。
过碘酸－雪夫(PAS)、Masson染色观察肾病理改变。根据Masson染色结果计算小管萎缩及间质纤维化损害占皮质区域面积百分比。
取约1 mm3肾皮质，2.5%戊二醛固定，1%四氧化锇(OsO4)后固定，脱水，浸透，包埋，切片，300目铜网捞片，醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色后透射电镜(JEM－1011，日本日立公司)观察、摄片。
4 μm石蜡切片常规脱蜡，3% H2O2阻断，1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X－100)处理5 min，2%牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min，微波修复。滴加适当浓度稀释的一抗(p62、OPN、p65抗体，分别1∶100、1∶200、1∶200稀释)，4 ℃过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记相应二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)37 ℃ 20 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察并摄片。参照文献[3]方法，对样本各抗原表达范围及强度分别进行半定量评估，得到最终的表达积分：(1)选取10个不重复视野(×200)并计算表达范围，分值为0～4分：0分为阴性，1分为肾小管上皮细胞着色面积不超过视野25%，2分为25%～49%，3分为50%～75%，4分为超过75%。评分，求和，取均值，得该抗原表达面积分值。(2)计算这10个视野抗原表达强度，分值为0～4分：阴性计0分，微量着色(淡黄)计1分，轻度着色(橙黄)计2分，中度着色(棕黄)计3分，广泛着色(深黄)计4分。评分，求和，取均值，得该抗原表达强度分值。(3)将抗原表达范围与强度的分值相乘，作为该抗原的表达积分。由2名有经验的病理医师评分，取均值为最终评分。
检测肾皮质p62、OPN、LC3、总p65与细胞核p－p65等蛋白表达。总蛋白提取方法：用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液[0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1%脱氧胆酸钠，0.1% Triton X－100，75 mmol/L氯化钠，5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷(pH 7.0)，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 μg/ml抑肽酶(aprotinin)，1 μg/ml亮抑蛋白酶肽]于4 ℃裂解组织，12 000×g低温离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度后，取30 μg蛋白100 ℃变性5 min，相应浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶室温封闭2 h，加封闭液稀释的一抗4 ℃过夜。加HRP标记的二抗室温反应1 h，化学发光剂反应。GAPDH为内参照。核蛋白提取参照说明书，用PBS清洗样品2～3次，加入蛋白抽提试剂A－MIX 800 μl，置玻璃均浆器冰上匀浆30次，时间2 min。将匀浆液转移至冷的离心管中，4 ℃条件下500×g离心10 min，弃去沉淀，收集上清，转移到离心管中，加入蛋白抽提试剂A－1 200 μl，震荡20 s，4 ℃孵育10 min后，3 000 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清；取蛋白抽提试剂B－MIX 100 μl加入离心管，震荡20 s，4 ℃，30 min，14 000 r/min，4 ℃离心2 min，上清转至新管中冷冻保存。采用FluorChem凝胶成像仪扫描成像，AlphaView软件定量分析。
应用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以
±s表示，同组两个时间点比较采用配对t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；采用Pearson相关分析两变量之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
所有大鼠注射STZ后均造模成功，至12周实验结束时无大鼠死亡。各组大鼠血清Scr差异均无统计学意义(均P>0.05)。DN组、DN＋PDTC组尿白蛋白明显高于其他两组，但DN＋PDTC组明显低于DN组(P<0.05，表1)。
各组大鼠不同时间点生化指标比较(
±s)
各组大鼠不同时间点生化指标比较(±s)
| 组别 | 鼠数 | 体重(g) | Scr (μmol/L) | 24 h尿蛋白(mg) | 血糖(mmol/L) | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | ||||||
| 第8周 | 6 | 335 ±43 | 66.11 ±13.20 | 3.0 ±1.6 | 4.1 ±1.5 | |
| 第12周 | 6 | 365 ±39 | 71.32 ±7.14 | 4.2 ±1.4 | 5.4 ±2.4 | |
| PDTC组 | ||||||
| 第8周 | 6 | 315 ±48 | 69.52 ±12.20 | 4.1 ±1.3 | 4.4 ±1.3 | |
| 第12周 | 6 | 335 ±66 | 82.30 ±16.92 | 5.5 ±2.3 | 5.1 ±1.3 | |
| DN组 | ||||||
| 第8周 | 6 | 188 ±42a | 77.03 ±20.33 | 50.1 ±12.3a | 27.1 ±5.5a | |
| 第12周 | 6 | 220 ±51a | 79.65 ±22.45 | 150.1 ±14.3ab | 28.1 ±3.4a | |
| DN＋PDTC组 | ||||||
| 第8周 | 6 | 190 ±46a | 87.23 ±23.50 | 31.4 ±14.0ac | 31.9 ±9.3a | |
| 第12周 | 6 | 239 ±66a | 79.31 ±12.69 | 58.2 ±24.3abc | 25.7 ±7.3a | |
注：PDTC：吡咯烷二硫代甲酸铵；DN：糖尿病肾病；Scr：血清肌酐；与对照组、PDTC组同一时间点相比，aP<0.01；与同组第8周时相比，bP<0.05；与DN组同一时间点相比，cP<0.05
PAS染色显示对照组(图1A)及PDTC组(图1B)肾小球及小管间质无明显病理改变，DN组肾小球体积增大，系膜细胞及基质增多，肾小管细胞肥大、泡沫样变、局灶性萎缩、轻度炎细胞浸润(图1C)，DN＋PDTC组以上病变明显减轻(图1D)。Masson染色示DN组肾小管小灶性萎缩，间质轻度纤维化，小管及间质损害占皮质区域面积(9.0±1.8)%，DN＋PDTC组以上病变较DN组明显减轻，占(4.5±1.0)%(P<0.05)。电镜下可见对照组(图2A，图2B)及PDTC组(图中未显示)肾小管上皮细胞线粒体结构完整，呈均匀棒状结构，有一定数量的自噬泡。DN组(图2C，图2D)及DN＋PDTC组(图2E，图2F)自噬泡明显减少，线粒体形状不一，部分发生水肿，直径增宽呈气球状。
免疫组化结果显示，对照组及PDTC组无明显p65表达，肾小管细胞仅表达少量OPN(图3A，图3B；图4A，图4B)。DN组肾小球及小管间质表达p65、OPN均显著增加(P<0.05，图3C、图4C)；DN＋PDTC组p65、OPN表达均明显低于DN组(P<0.05，图3D、图4D)。各组使用PBS代替一抗孵育的阴性对照片未见p65、OPN表达。
Western印迹显示，DN组肾皮质p62、OPN、总p65、核p－p65蛋白表达较对照组及PDTC组明显增加，LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ比值明显下降(均P<0.05)；DN＋PDTC组较DN组显著改善(均P<0.05，图5，图6)。
肾皮质LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ与核p－p65、OPN表达水平呈负相关(r＝－0.45，P＝0.02；r＝－0.50，P＝0.01)，p62表达与核p－p65、OPN表达水平呈正相关(r＝0.33，P＝0.01；r＝0.41，P＝0.01)。
炎症与自噬之间有着明确的联系[5,6]。在肿瘤细胞，炎症对自噬的抑制作用是肿瘤细胞生长、扩散的重要机制[7]。本研究首次在动物实验中观察了糖尿病肾病大鼠肾小管细胞炎症与自噬的关系，并探讨了这一联系的可能机制。
PDTC是NF－κB特异性抑制剂[3]。本研究证实，PDTC可明显抑制肾组织NF－κB p－p65核转位及小管间质炎症、纤维化过程。NF－κB是调节炎症反应的主要转录因子之一，在糖尿病肾病的发生发展中有重要作用。在培养的肾小管上皮细胞中，阻断NF－κB可抑制高糖诱导的氧化应激及炎症因子表达[8]。我们最近在DN患者肾活检标本中发现，NF－κB与肾小管细胞OPN表达、肾间质成纤维细胞α－SMA表达及蛋白尿程度等均有密切关系，提示NF－κB是导致DN肾小管间质纤维化和蛋白尿的重要炎症介质。我们发现，PDTC抑制小管间质炎症的同时，也减少了DN大鼠尿蛋白量，进一步支持NF－κB在蛋白尿产生中的重要作用。另外，不可否认，PDTC同样对肾小球炎症反应有重要的抑制作用[9]，后者也同样是蛋白尿减少的重要机制。
自噬是在进化过程中被保留的重要细胞活动，是细胞对饥饿等应激性刺激的代偿反应[4]。在急性肾损伤、梗阻性肾病中，自噬反应明显增强，以利于修复病变组织[10]。最近发现，肥胖相关肾损害或DN动物模型及DN患者肾小管上皮细胞存在明显的自噬障碍，表现为自噬活性降低，细胞内与自噬相关的代谢产物清除减少，导致其在细胞内堆积，推测这是导致肾小管细胞凋亡和细胞外基质增加的重要原因[11,12]。本研究发现，自噬的减少与小管细胞内线粒体损害、炎症因子表达及间质炎症细胞浸润、纤维化等过程伴随发生，关系密切。
炎症与自噬之间的互相影响可能与炎症对NF－κB活性的调节密切相关[5,13]。在巨噬细胞中，炎症通过Toll样受体2(TLR2)促进了自噬诱导的NF－κB p65磷酸化，而自噬抑制剂巴弗洛霉素A1则可阻断NF－κB的活化[14]。另一方面，NF－κB也可抑制自噬活性。Djavaheri－Mergny等[15]发现，NF－κB可抑制肿瘤坏死因子α(TNF－α)诱导的尤文氏瘤细胞自噬；Colleran等[16]在小肠上皮细胞中也有类似发现。Jiang等[17]进一步证实，抑制NF－κB可增加自噬抑制分子Beclin 1基因的表达，抑制自噬发生，使p62堆积增加。Khan等[18]发现，糖尿病大鼠肾小球足细胞NF－κB与自噬之间存在相互作用。NF－κB与自噬的相互作用的机制尚未明确，Chang等[19]发现，NF－κB下游炎症分子OPN可明显抑制人肺癌细胞自噬。Zhang等[20]发现，敲除乳腺癌细胞OPN表达后，自噬表达明显增强，p62表达增加，癌细胞侵袭力则显著下降。本研究发现，DN大鼠肾小管细胞NF－κB p65激活、OPN的表达与自噬活性密切相关，提示NF－κB/OPN/自噬通路可能是DN小管间质损害的新机制，但这一假设尚须进一步研究证实。
总之，本研究发现，通过PDTC直接抑制NF－κB p65活性，可明显抑制DN大鼠肾小管间质炎症，增强自噬活性，减轻尿蛋白。PDTC无明显细胞毒性，安全剂量范围较广，有望成为防治DN的新手段。
