了解重症医学科(ICU)内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药性、同源性等分子流行病学特点。
收集鉴定2010年10月至2011年12月全国10家医院ICU患者痰培养的MRSA菌株149株。检测其对18种抗菌药物的耐药性,利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行同源性分析,并应用多位点序列分析(MLST)技术进一步进行序列型(ST)分型。
149株MRSA对万古霉素、达托霉素及利奈唑胺100%敏感,复方新诺明耐药率约在0~11.1%之间;利福平在2家医院耐药率<25%;庆大霉素、莫西沙星的耐药率除3家在50%~70%外均在80%以上;β-内酰胺类的耐药率高达100%。149株MRSA中,PFGE主要型别为J(28.9%)、C(19.5%)、G(10.7%)、F(8.0%) 4型,J、C、G 3型主要分布在北方地区,而F型只分布在贵阳地区。MLST分型:最终确定了8个ST型别,其中以ST-239为主(67株,45.0%),在南北方均有分布;其次为ST-5(54株,36.2%),主要分布在东北地区(χ2=26.42,P<0.01)。
ICU内MRSA对万古霉素、达托霉素及利奈唑胺仍100%敏感;MRSA的区域性同源性较高,可能存在同源性播散性情况,需要继续加强监测并采取有效的院感控制措施避免MRSA同源暴发流行。
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)感染率有逐年增加的趋势,尤其在ICU内MRSA引起的医院感染更是极为常见[1,2]。按照MRSA的分子生物学分型进行流行病学监测对于观察MRSA的同源性、确定暴发流行菌株的基因型及扩散趋势具有十分重要的意义[3,4,5]。有调查显示,中国MRSA占金葡菌感染的比例甚至可高达82.4%[6]。脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)是目前对MRSA进行同源性分析的最经典方法[7],而多位点序列分析(multilocus sequencing typing,MLST)技术,则可对MRSA菌株进行进一步的基因分型并进行国际标准化的比较[8]。本研究采用上述两种经典方法,对医院综合重症医学科(ICU)患者的痰中MRSA菌株进行了初步的调查,旨在发现ICU患者痰中MRSA的主要分子生物学类型及分布,并为今后的相关研究提供分子流行病学背景资料。
2010年10月至2011年12月间全国10家教学医院综合ICU患者痰培养初步分离鉴定出的MRSA菌株187株,所有菌株均为连续分离的非重复株,汇总到大连医科大学附属第一医院重新鉴定,最终将符合研究要求的149株MRSA纳入研究。其中,大连医科大学附属第一医院51株,首都医科大学附属复兴医院17株,吉林大学附属第一医院15株,贵阳医学院附属医院15株,中国医科大学附属第一医院12株,河北医科大学附属第四医院12株,天津市第三中心医院7株,哈尔滨医科大学附属第一及第二医院14株,温州医学院附属第一医院6株。
按照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的头孢西丁纸片扩散法进行MRSA初步筛选[9],判断标准为头孢西丁抑菌圈直径≥22 mm为敏感,≤21 mm为MRSA,进一步鉴定采用Mico Scan Walk Always 96全自动微生物鉴定仪(西门子),以头孢西丁/苯唑西林MIC≥4 mg/L为MRSA鉴定标准。同时以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923作对照质控菌株。
将各个MRSA菌株接种鉴定后,取单个菌落接种于5 ml MHB(Mueller-Hinton broth)中37 ℃扩增,取吸光度(A)值为4.0的MRSA悬浊液400 μl置于1.5 ml eppendorf管中,完成PFGE分型检测。具体操作步骤如文献[7]。采用SPSS 19.0软件进行聚类分析并构建树状图,以85%的相似度为界进行分型,按照英文大写字母顺序将相似度≥85%的菌株命名为同一类型(如:A型、B型……),与其他任何菌株均无相似的单独菌株命名为U(不同单独菌株用阿拉伯数字区别,如:U1、U2……)。
将MRSA单个菌落接种于5 ml MHB中37 ℃摇菌18 h,至A0.7,行MLST检测。具体操作步骤如文献[8]。PCR扩增7个管家基因的内部片段(引物序列见表1)进行PCR纯化及序列分析。将7个管家基因(house-keeping gene)的测序结果通过MLST分型网站(http://www.mlst.net)最终确定MRSA的等位基因谱,以序列型(sequence type,ST)表示型别。
yqiL | YqiL-Up | CAGCATACAGGACACCTATTGGC | 516bp |
---|---|---|---|
YqiL-Dn | CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC | ||
tpi | Tpi-Up | TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA | 402bp |
Tpi-Dn | TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC | ||
pta | Pta-UP | GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG | 474bp |
pta-Dn | GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA | ||
gmk | gmK-UP | ATCGTTTTATCGGGACCATC | 429bp |
gmK-Dn | TCATTAACTACAACGTAATCGTA | ||
glpF | GlpF-UP | CTAGGAACTGCAATCTTAATCC | 465bp |
GlpF-Dn | TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC | ||
aroE | AroE-UP | ATCGGAAATCCTATTTCACATTC | 456bp |
AroE-Dn | GGTGTTGTATTAATAACGATATC | ||
arcC | ArcC-UP | TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC | 456bp |
ArcC-Dn | AGGTATCTGCTTCAATCAGCG |
注:MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
数字统计采用描述性分析,抗菌药物的耐药率用百分率(%)表示。采用PFGE谱型树状图分析菌株的分布。
149株MRSA对18种抗菌药物的敏感试验结果显示,对万古霉素、达托霉素及利奈唑胺最敏感,耐药率为0%;氯霉素引起严重不良反应未纳入本研究,复方新诺明敏感性也相对较高;利福平在2家医院耐药性低于25%;庆大霉素、莫西沙星的耐药率除3家在50%~70%外均在80%以上;β-内酰胺类的耐药率高达100%(表2)。
抗菌药物 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
万古霉素 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
利奈唑胺 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
达托霉素 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
复方新诺明 | 3.2 | 0.0 | 0.0 | 11.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
利福平 | 11.3 | 100.0 | 100.0 | 88.9 | 22.2 | 100.0 | 100.0 | 87.5 | 100.0 | 60.0 |
莫西沙星 | 82.7 | 100.0 | 70.0 | 94.4 | 55.0 | 94.4 | 100.0 | 100.0 | 80.0 | 100.0 |
庆大霉素 | 62.8 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 90.0 | 100.0 | 100.0 | 87.5 | 100.0 | 100.0 |
阿莫西林/克拉维酸 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
氨苄西林 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
氨苄西林/舒巴坦 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
苯唑西林 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
红霉素 | 92.6 | 100.0 | 100.0 | 83.3 | 100.0 | 94.4 | 100.0 | 81.2 | 100.0 | 100.0 |
环丙沙星 | 86.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
氯林可霉素 | 84.5 | 100.0 | 100.0 | 88.9 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.5 | 100.0 | 100.0 |
青霉素G | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
四环素 | 83.5 | 100.0 | 80.0 | 100.0 | 100.0 | 94.4 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
头孢曲松 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
左氧氟沙星 | 84.9 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 89.5 |
注:ICU:重症医学科;MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。1:大连医科大学附属第一医院;2:首都医科大学附属复兴医院;3:吉林大学附属第一医院;4:贵阳医学院附属医院;5:中国医科大学附属第一医院;6:河北医科大学附属第四医院7:天津市第三中心医院;8:哈尔滨医科大学附属第一医院;9:哈尔滨医科大学附属第二医院;10:温州医学院附属第一医院
通过PFGE谱型树状图分析,149株MRSA中,128株分布在12个PFGE类型中(以英文大写字母A-L表示);另有21株单个MRSA未找到匹配的同源菌株(以U1-21表示),见表3。PFGE主要型别为J、C、G、F 4型,其中J型43株占比最高(28.9%),其后依次为C型29株(19.5%)、G型16株(10.7%)、F型12株(8.0%)。上述四型中J、C、G 3型主要分布在北方城市(如北京、沈阳、大连、哈尔滨、长春等),而F型只分布在南方的贵阳市。
FGE分型 | 大连(51) | 北京(17) | 长春(15) | 贵阳(15) | 沈阳(12) | 石家庄(12) | 天津(7) | 哈尔滨(14) | 温州(6) |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A(3) | 3 | ||||||||
B(2) | 2 | ||||||||
C(29) | 3 | 9 | 8 | 1 | 3 | 5 | |||
D(3) | 2 | 1 | |||||||
E(3) | 1 | 1 | 1 | ||||||
F(12) | 12 | ||||||||
G(16) | 4 | 5 | 3 | 1 | 3 | ||||
H(4) | 1 | 3 | |||||||
I(3) | 2 | 1 | |||||||
J(43) | 26 | 1 | 11 | 5 | |||||
K(5) | 1 | 4 | |||||||
L(5) | 5 | ||||||||
U(21) | U1、3、4、5~8、11~14、18、21 | U20 | U15、16 | U17 | U9 | U2、10、19 |
注:MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
149株MRSA根据7个管家基因的测序结果按照MLST分型标准最终确定了8个ST型别,分别为ST-1(1株)、ST-5(54株,36.2%)、ST-7(2株)、ST-15(3株)、ST-20(1株)、ST-59(16株)、ST-239(67株,45.0%)、ST-946(5株)。MLST型别以ST-239和ST-5为主,其中ST-239占45.0%,等位基因序列号为1-4-1-4-12-1-10,在南北方均有分布;ST-5占36.2%,等位基因序列号为2-3-1-1-4-4-3,主要分布在沈阳、哈尔滨、长春及大连等东北城市(χ2=26.42,P<0.01);其他ST型别占比较低呈零星分布,MLST主要分型的城市分布(表4)。
ST分型 | 贵阳(15) | 北京(17) | 沈阳(12) | 哈尔滨(14) | 温州(6) | 天津(7) | 长春(15) | 石家庄(12) | 大连(51) |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
ST-1 | 1 | ||||||||
ST-5 | 2 | 11 | 9 | 1 | 2 | 3 | 26 | ||
ST-7 | 2 | ||||||||
ST-15 | 3 | ||||||||
ST-20 | 1 | ||||||||
ST-59 | 1 | 1 | 4 | 1 | 6 | 3 | |||
ST-239 | 12 | 14 | 1 | 5 | 3 | 3 | 12 | 3 | 14 |
ST-946 | 3 | 1 | 1 |
注:MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
本次调查研究对纳入全国9个中心城市10家教学医院综合ICU患者痰培养分离鉴定出的149株MRSA进行分析,药敏试验结果显示,MRSA对万古霉素、达托霉素及利奈唑胺的敏感性仍保持在100%,可继续作为目前临床抗MRSA的一线用药;对复方新诺明、利福平及莫西沙星的敏感性也相对较高,可能与这些药物在临床暴露较少有关;而对其他10余种抗菌药物的敏感性已很低,应注意避免经验性应用。因此,十分有必要通过流行病学调查确定不同地区ICU内MRSA的同源性及基因分型特点,为进一步观察MRSA流行趋势及相关院感措施的制定提供分子流行病学背景资料。
本次调查首次对全国9个中心城市ICU患者痰液中的MRSA应用PFGE技术进行了同源性分析。PFGE分型是通过限制性内切酶对染色体基因组的整体基因片段进行分析的方法,主要应用于近期内引发感染性疾病的菌株间同源性分析,其分辨能力强,曾被认为是MRSA分型的"金标准" [10]。本研究收集的149株MRSA的PFGE分型表现出一定的集中趋势,在北方城市PFGE分型以J、C、G 3型为主,而贵阳以F型为主,提示MRSA已存在区域性同源播散的可能性。尽管PFGE分型分辨率高,可作为同源性分析的有效手段,但PFGE分型需要特殊仪器设备,技术相对复杂,最大的缺陷是其分型结果不易在实验室间进行比较和分析,需要相互一致的试验条件才行[11]。因此,为了便于进行国际标准化比较,本研究同时对收集的MRSA菌株样本进行了MLST分型研究。
Enright等[8]首先将MLST应用于金黄色葡萄球菌的分型,该技术以7个相隔一定距离且基本覆盖整个染色体的管家基因测序为基础,通过分析7个管家基因的内部片段的核酸序列,将每一组不同的等位基因的排列组合作为一个基因型构成等位基因图谱,每个独特的基因型就对应了一个ST。MLST使MRSA流行分布进行国际标准化比较成为可能,并可帮助长期追踪观察菌株间遗传关系和宏观进化过程。本次全国9个中心城市ICU内MRSA的MLST分型ST-239占比最高(占45.0%),既往调查显示此型为亚洲大部分地区MRSA的主要流行株,在亚洲地区占统治地位[12,13],这表明在中国ICU内MRSA的MLST分型尚未出现显著的飘移,与亚洲其他地区MRSA主要流行株基本一致,但同时也提示中国ICU内MRSA同源性播散的可能性极大。本研究占比第二高的为ST-5(占36.2%),也是亚洲地区第二主要流行株,并且主要分布在日本和韩国等国[13,14,15]。本次调查ST-5主要分布在沈阳、哈尔滨及大连等与日韩毗邻的东北亚地区,表明此地区ST-5克隆株仍处于相对优势地位,而且尚未发现明显的向中国内地地区扩散的趋势,同时ST-5在此地区的集中分布也间接反映MRSA存在局部地区同源性播散的可能。
本次研究最初共收集到189株MRSA,但由于非大连城市的MRSA需要留取菌株提纯保存后转运至大连医科大学附属第一医院,涉及到标本提取、封存、转运、再次培养等诸多环节,使得许多标本转运到大连后发现被污染或失效,最终只有149株符合条件纳入。而大连本地菌株基本不涉及上述环节,被污染的机会较少,因此所占比例较高,使得菌株分布可能存在偏倚。但通过与既往国际及国内相关研究进行横向比较,发现本次研究的结果基本符合MRSA的分布规律,因此可以认为结果是可靠的。
总之,从宏观角度调查不同地区MRSA的分子生物学特征,不仅对于了解MRSA菌株间的同源相关性及基因型分布具有重要意义,而且有利于通过对比发现MRSA的流行环节线索,并可为进一步采取有效的感染控制措施阻断MRSA在人群中的传播及暴发流行提供重要的分子流行病学信息及依据。本调查研究提示目前中国9大中心城市ICU患者痰液中MRSA仍以ST-239同源性播散为主,东北亚地区则以ST-5为主,因此需要进一步做好MRSA患者的隔离并加强院感控制措施,尽可能避免交叉感染及暴发流行的发生。
本研究协作组成员:大连医科大学附属一院(万献尧、毕丽岩、秦永新、李青栋、王晶);首都医科大学附属复兴医院(姜利);吉林大学第一医院(王育珊);贵阳医学院附属医院(王迪芬);中国医科大学附属第一医院(马晓春);河北医科大学第四医院(胡振杰);天津市第三中心医院(秦英智);哈尔滨医科大学附属第二医院(于凯江);哈尔滨医科大学附属第一医院(赵鸣雁);温州医学院附属第一医院(林锡芳)