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基础研究
子宫内膜间质细胞共培养促进月经血干细胞向子宫内膜上皮细胞分化的研究
中华医学杂志, 2017,97(33): 2614-2619. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.33.013
摘要
目的

体外诱导月经血子宫内膜间充质干细胞(MenSC)向子宫内膜上皮细胞分化。

方法

培养MenSC和子宫内膜间质细胞(ESC)并鉴定,将MenSC与ESC共培养,同时补充生长因子(TGF-β1 10 ng/ml,EGF 10 ng/ml,PDGF-BB 10 ng/ml)和雌激素(17-β-雌二醇1×10-7 mol/L),之后免疫荧光染色检测分化的MenSC是否表达上皮细胞特异标记细胞角蛋白(CK)。

结果

MenSC生长良好,10代以内均表现出明显的梭状形态,结构紧密,其表面标记CD44、CD90、CD73和CD29表达率分别为98.4%、90.77%、94.75%和97.01%。ESC特异标记波形蛋白表达阳性。MenSC与ESC共培养3周后细胞形态基本由成纤维样向上皮样细胞转变,免疫荧光鉴定诱导分化后的MenSC表达细胞角蛋白。

结论

在ESC共培养环境的诱导下,MenSC可向子宫内膜上皮细胞分化。细胞生长因子和雌激素在这一进程中发挥重要作用。

引用本文: 江寅申, 竺海燕, 金晓莹, 等.  子宫内膜间质细胞共培养促进月经血干细胞向子宫内膜上皮细胞分化的研究 [J]. 中华医学杂志,2017,97( 33 ): 2614-2619. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.33.013
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不孕不育已成为继癌症、心血管疾病之后的第3大严重疾病,人类健康繁衍的生育问题已经是全世界面临的重要问题。而辅助生殖技术(ART)的快速发展为解决这一社会问题做出了重要贡献。尽管ART已得到长足发展,但不孕夫妇首次就诊治疗的成功率仍旧很低。

在不孕不育治疗实践中已认识到,良好的内膜和高质量的胚胎及二者的同步性是助孕成功的关键。子宫内膜作为胚胎种植和发育的"土壤",其在助孕中有举足轻重的作用。因子宫内膜损伤,粘连和缺如等导致的子宫内膜过薄可阻碍受精卵在子宫内膜着床和发育。子宫内膜间充质干细胞是子宫内膜具有高度再生能力的原因,随着月经期子宫内膜的脱落混入月经血中,即经血干细胞[1,2,3,4]。大量研究已经证实,从女性月经血中提取的经血干细胞具有间充质干细胞增殖及多向分化特性,可修复受损肝脏及胰脏,改善肝脏及胰脏功能[5,6]。然而,如何诱导经血干细胞向子宫内膜上皮分化,促进受损子宫内膜再生尚未可知。本研究中拟通过体外生长因子诱导及子宫内膜间质细胞共培养途径,探索诱导经血干细胞向子宫内膜上皮细胞分化的最佳条件。

材料与方法
1.材料:

女性子宫内膜组织取自邵逸夫医院妇产科宫腔镜手术患者。经患者知情同意,术前签署同意书,自愿将子宫内膜组织交由医院处理或供科研所用。手术前行乙型肝炎病毒(HBV)抗原、抗HBV抗体、抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体、抗人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体、梅毒螺旋体及支原体等检测均阴性。无菌条件下采集内膜组织后,置培养基中4 ℃保存4 h内处理。实验试剂:DMEM/F12 (吉诺生物),胎牛血清(Gibco),胰蛋白酶(Gibco),米非司酮(美国Sigma公司),甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司),胶原酶Ⅰ(Gibco公司),200目滤网(BD),4%多聚甲醛(北京鼎国公司),免疫组化试剂盒(福州迈新公司)。MenSC培养基(易文赛生物公司),CK和Vimentin抗体(中杉金桥公司)。细胞株:月经血子宫内膜间充质干细胞(MenSC)购自杭州易文赛生物。

2.方法:

(1)月经血子宫内膜间充质干细胞(MenSC)的培养及鉴定:①MenSC的培养:月经血子宫内膜间充质干细胞(MenSC)及其完全培养基均购自杭州易文赛生物。将购得的MenSC从液氮中复苏并按1∶2传代,培养至细胞融合度为90%时传代,传至P3代时流式鉴定。②MenSC的鉴定:流式细胞术检测间充质干细胞的特异性标志物:MenSC扩大培养到P4,准备5个10 cm培养皿的长满的MenSC,分成12份,8个抗体,3个同型,1个空白。弃培养基,磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍,每皿加2 ml PBS,刮刀刮下,另加1 ml PBS洗刮下的细胞碎屑,转移至新的管中离心,共分为4个大管,1 350 r/min室温离心6~10 min,弃上清,每管中加300 μl 1%牛血清白蛋白(BSA),封闭重悬,冰上孵育30 min以上。封闭后的液体混匀后分装至1.5 ml EP管,每管约100 μl细胞悬液。加抗体孵育,按顺序排列如下:空白对照管不加抗体、大鼠IgG2b k同型对照FITC(eBioscience 11-4031)2 μl、大鼠抗人/小鼠CD44 FITC(eBioscience 11-0441)2 μl、小鼠IgG1 k同型对照FITC(eBioscience 11-4714)5 μl、小鼠抗人CD90(Thy-1)FITC(eBioscience 11-0909)5 μl、小鼠抗人CD73 FITC(eBioscience 11-0739)5 μl、小鼠抗人CD29(Integrin beta1)FITC(eBioscience 11-0299)5 μl、小鼠IgG1 k同型对照PE(eBioscience 12-4714)5 μl、小鼠抗人CD117(c-kit)PE(eBioscience 12-1178)5 μl、小鼠抗人CD34 PE(eBioscience 12-0349)5 μl、小鼠抗人CD45 PE(eBioscience 12-0459)5 μl及小鼠抗人HLA-DR PE(eBioscience 12-9952)5 μl,抗体避光,冰上摇动30 min以上,加1 ml PBS,1 350 r/min室温离心5 min,弃上清,加1%多聚甲醛固定,4 ℃避光保存,流式上机检测。(2)人子宫内膜间质细胞(ESC)的分离培养与鉴定:①ESC分离培养:采用酶消化法分离培养。用含青链霉素的D-Hanks缓冲溶液洗涤去除子宫内膜组织残存血,将组织剪碎至1 mm的小块,加入0.1%胶原酶Ⅰ和DNase,37 ℃消化45 min,之后用10%FBS的DMEM/F12培养基中终止消化,200目滤网过滤,收集到细胞悬液,500 r/min, 5 min离心2次,去除上清,加10%FBS的DMEM/F12重悬,置37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中进行培养,3 d后去除少量残留组织块,全量换液。原代细胞培养至10~14 d后,胰蛋白酶消化后传代,P1后各代细胞达90%以上融合时传代。②ESC的鉴定:免疫组化检测间质细胞标志物Vimentin表达。免疫组化试剂盒来自福州迈新(UltraSensitive™ S-P超敏试剂盒,# KIT-9710)。以3×105/ml的细胞密度将将P1传代后的子宫内膜细胞接种到6孔板的细胞爬片中,达90%以上融合时,4%多聚甲醛固定爬片25 min,去除多聚甲醛,PBS洗3次,每次3 min;内源性过氧化物酶阻断剂室温处理10 min,PBS洗3次,每次3 min;加羊血清室温封闭10 min后去除;加Vimentin一抗(小鼠抗Vimentin单抗,中杉金桥,#ZM-0260)在湿盒中4 ℃孵育过夜,PBS洗3次,每次5 min;二抗(生物素标记的羊抗小鼠IgG)37 ℃孵育10 min,PBS洗3次,每次5 min;链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶室温孵育10 min,PBS洗3次,每次3 min;除去PBS,加100 μl新鲜配制的DAB溶液处理3~10 min;自来水冲洗,苏木精复染,PBS冲洗返蓝;经过梯度乙醇脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。显微镜下观察并进行图像采集。(3)MenSC与ESC共培养诱导分化并鉴定:用孔径为0.4 μm的transwell小室(Corning,#3412)建立MenSC-ESC共培养系统。系统中先将MenSC接种在下室(即6孔板底部),再将ESCs接种到上室(即transwell嵌套中),通过transwell膜将MenSC与ESC隔开,但细胞分泌的各种因子可以自由透过,从而实现两种细胞的非接触式共培养。将MenSC(P3)以5×105/ml的细胞密度接种到6孔板中,同时将ESC(P3)以2×105/ml的细胞密度接种到transwell小室中。实验分为4组,培养基均为2%FBS-DMEM/F12,第1组为对照组1,MenSC单独培养,;第2组为对照组2,MenSC与ESC共培养不加诱导因子;第3组为诱导组,MenSC单独培养,培养基中添加10 ng/ml TGF-β1,10 ng/ml EGF,10 ng/ml PDGF-BB和1×10-7mol/L 17-β-雌二醇;第4组为共培养诱导组,MenSC与ESC共培养,培养基为诱导培养基,与第3组相同。培养3周之后,免疫荧光检测每组MenSC中细胞角蛋白(CK)的表达差异。将培养3周后的各组MenSC分别接种到细胞爬片上,甲醇低温固定20 min,去除甲醇自然干燥5 min,PBS洗3次,每次3 min;1%Triton X-100破膜15 min,PBS洗净;加5%BSA室温封闭1 h后去除;加CK一抗(小鼠抗人CK单抗,中杉金桥,#ZM-0069)在湿盒中4 ℃孵育过夜,PBS洗3次,每次5 min;加荧光二抗(DyLight 488山羊抗小鼠IgG,联科生物,#GAM4882),37 ℃避光孵育1 h,PBS洗3次,每次5 min;DAPI复染细胞核,避光孵育5 min。甘油封片,在荧光显微镜下进行图像采集,绿色荧光代表CK表达阳性,蓝色荧光为细胞核。

结果
1.MenSC生长特性及鉴定:

MenSC复苏第2天即可贴壁生长,初期为圆形,第3天开始伸展,开始大量扩增,并渐渐变为长梭形,呈现出成纤维细胞的形态,第5天融合度可达90%以上,平行排列呈漩涡状,可以传代。传代之后细胞贴壁速度明显加快,5 h以内完全贴壁生长,24 h内可呈现梭形,4~5 d后基本长满,可传代。细胞形态稳定,生长良好。流式细胞仪检测MenSC(P2)结果显示:间充质干细胞标志物CD44、CD90、CD73、CD29表达率分别为98.4%、90.77%、94.75%和97.01%,造血干细胞标志物CD45表达率为3.91%,见图1图2图3。间充质干细胞表面标记CD44、CD90、CD73、CD29表达率分别为98.4%、90.77%、94.75%和97.01%。而CD117、CD34、CD45和HLA-DR表达率分别为0.83%、4.38%、3.91%和1.01%。

图1
MenSC(P3)正常培养,光镜下明场拍摄 ×100
图1
MenSC(P3)正常培养,光镜下明场拍摄 ×100
图2
流式细胞仪鉴定MenSC的干细胞特性
图2
流式细胞仪鉴定MenSC的干细胞特性
图3
ESC培养与鉴定×100。3A.ESC(P3)正常培养;3B.ESC(P3)免疫组化鉴定Vimentin染色呈阳性
图4
MenSC经过诱导之后细胞形态变化以及细胞角蛋白(CK)的免疫荧光鉴定。经过3周诱导的MenSC细胞形态的变化×100 。4A~D.依次为对照组、MenSC诱导组、共培养对照组和共培养诱导组,在光镜下的形态变化,MenSC形态从成纤维样转变为上皮细胞样;4E~P.诱导分化后免疫荧光染色检测MenSC细胞角蛋白(CK)的表达 ×400,其中4E~G为对照组,4H~J为MenSC诱导组,4K~M为共培养对照组,4N~P为共培养诱导组。4E,H,K,N为CK染色,4F,I,L,O为DAPI细胞核染色,4G,J,M,P为融合图像。共培养诱导分化组的CK表达最强
图3
ESC培养与鉴定×100。3A.ESC(P3)正常培养;3B.ESC(P3)免疫组化鉴定Vimentin染色呈阳性
图4
MenSC经过诱导之后细胞形态变化以及细胞角蛋白(CK)的免疫荧光鉴定。经过3周诱导的MenSC细胞形态的变化×100 。4A~D.依次为对照组、MenSC诱导组、共培养对照组和共培养诱导组,在光镜下的形态变化,MenSC形态从成纤维样转变为上皮细胞样;4E~P.诱导分化后免疫荧光染色检测MenSC细胞角蛋白(CK)的表达 ×400,其中4E~G为对照组,4H~J为MenSC诱导组,4K~M为共培养对照组,4N~P为共培养诱导组。4E,H,K,N为CK染色,4F,I,L,O为DAPI细胞核染色,4G,J,M,P为融合图像。共培养诱导分化组的CK表达最强
2.ESC培养及鉴定:

子宫内膜标本分离培养成功。分离出的ESC为单个细胞,4~5 h可贴壁,培养48 h已完全贴壁。初期贴壁的ESC呈三角形,均匀分布,细胞质薄且透明,有短小突起。培养1周细胞开始加速生长,传代后细胞多数为具有成纤维细胞形态的梭形细胞,胞质丰富,核椭圆,至少可稳定传代7~8次。免疫组化检测结果表明,原代培养的ESC波形蛋白Vimentin染色呈阳性;细胞纯度可达95%以上。

3.MenSC与ESC共培养并加诱导因子之后的细胞特性及鉴定:

经过3周的共培养诱导分化之后,诱导组和共培养诱导组MenSC部分细胞形态明显发生变化,呈现出多角形,细胞数量变少,而两个对照组细胞数量和形态较之前的成纤维样变化不大。免疫荧光检测表明诱导组部分细胞呈现出细胞角蛋白阳性,共培养诱导组大多数细胞都呈现细胞角蛋白阳性,而两个对照组的CK染色均呈现阴性结果。这说明经过诱导和共培养诱导之后,MenSC可以向上皮方向分化,见图4

4.MenSC诱导上皮化过程中细胞角蛋白CK7表达量的检测:

经过3周的共培养诱导分化之后,与对照组相比,共培养对照组和共培养诱导组CK7表达均有升高,而共培养诱导组的CK7表达量显著增高,差异有统计学意义,P<0.05。这表明,MenSC在添加诱导因素之后的确向上皮细胞分化,见图5

图5
MenSC经过诱导之后上皮细胞标志物CK7蛋白表达量的变化。免疫印迹检测MenSC在诱导分化过程中CK7的蛋白表达变化。上图为4组分别为对照组、MenSC诱导组、共培养对照组和共培养诱导组,下图为CK7的蛋白表达变化的定量统计结果(aP<0.05)
图5
MenSC经过诱导之后上皮细胞标志物CK7蛋白表达量的变化。免疫印迹检测MenSC在诱导分化过程中CK7的蛋白表达变化。上图为4组分别为对照组、MenSC诱导组、共培养对照组和共培养诱导组,下图为CK7的蛋白表达变化的定量统计结果(aP<0.05)
讨论

根据干细胞多向分化的特性,通过添加各种外源因子,将月经血干细胞诱导分化为子宫内膜上皮细胞,不仅有助于了解子宫内膜在胚胎种植中的作用,而且能有利于子宫内膜上皮细胞的药物模型的建立。近来研究表明,与ESC共培养可促进人胚胎干细胞分化成子宫内膜样细胞[7,8]。因此,本研究通过将MenSC与ESC共培养,同时添加3种生长因子以及雌激素,诱导MenSC上皮化,通过体外研究发现MenSC在子宫内膜微环境中可向子宫内膜上皮细胞方向分化,参与子宫内膜上皮再生,促进子宫内膜修复,治疗女性子宫内膜损伤提供理论依据。

干细胞的自我更新和分化需要大量的内源性蛋白和培养基中添加的外源细胞因子。在条件培养基或适合的培养环境的的影响下,干细胞会定向分化成特定类型的体细胞,成为研究细胞分子机制和建立疾病体外模型的工具。

传统的干细胞诱导方法包括细胞因子诱导法、共培养方式诱导法、化学诱导剂诱导法和转基因诱导法等。其中应用最多的是前两种方法,细胞因子诱导是在干细胞培养基中添加生长因子和其他外源诱导因子来促使干细胞定向分化,而共培养诱导则是将干细胞和目标组织来源的体细胞放在非接触式的transwell系统中进行共培养,通过体细胞分泌的细胞因子将干细胞诱导成我们需要的细胞类型。transwell系统可以有效隔绝共培养的两种细胞,避免二者相互接触,从而杜绝了二类细胞共培养逐渐演变成一种细胞单独培养的可能性。

体外诱导子宫内膜干细胞分化成子宫内膜上皮细胞,有助于我们探究子宫内膜损伤修复的分子机制。有报道称子宫内膜条件培养液联合雌激素可诱导兔骨髓间充质干细胞向子宫内膜上皮细胞分化[9],用共培养体系加外源因子的方法可诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化成子宫内膜上皮细胞[10],因此,本研究用人月经血来源的MenSC与ESC建立transwell共培养系统,在此基础上对比之前报道的骨髓间充质干细胞诱导上皮化的相关研究,选择了添加3种生长因子(TGF-β1,EGF,PDGF-BB)和雌激素(17-β-雌二醇),并经过预实验确定了各因子浓度适合于MenSC诱导分化,体外构建一个子宫内膜的微环境,诱导MenSC向子宫内膜上皮细胞方向分化。

MenSC是一种来源于人子宫内膜,具有快速增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞,扩大培养速度快,体外实验周期短,传代次数较多,操作简便,适合作为诱导分化实验的研究对象。本研究培养的MenSC早期呈现出梭状的形态,随着传代次数的增加逐渐变为成纤维状,细胞形态趋于一致,10代以内细胞增殖力极强,流式检测结果显示,间充质干细胞表面标记CD44、CD90、CD73、CD29表达呈阳性,而CD117、CD34、CD45和HLA-DR则呈阴性,这说明本实验培养的MenSC具有一定的干性,适用于科学研究。

本研究建立的transwell共培养系统可以一定程度上在体外模拟体内的子宫内膜微环境,隔绝MenSC与ESC,使得两种细胞在一个系统中分别生长,不会交叉污染,但ESC分泌的各种细胞因子可自由透过0.4 μm聚碳酸酯膜作用到下室的MenSC,影响其生长,与此同时添加的各种诱导因子(包含3种生长因子和雌激素)共同构成并模拟了MenSC体内增殖分化的子宫内膜微环境,有利于MenSC向子宫内膜上皮方向分化。结果表明,相较于对照组和非共培养诱导组,共培养诱导组的诱导分化效果更加明显。在ESC分泌的细胞因子和外源添加的各种诱导因子协同作用之下,MenSC细胞形态明显发生变化,从成纤维样转变为上皮特征的多角形,同时MenSC细胞角蛋白(CK)表达呈阳性,而对照组无论从细胞形态到CK表达均无上皮特性,蛋白定量分析也显示MenSC在诱导之后CK7表达显著升高。这初步提示在添加的诱导因素作用下,MenSC可以向子宫内膜上皮细胞分化,且最佳的条件就是ESC共培养外加加TGF-β1,EGF,PDGF-BB和17-β-雌二醇。与单纯外源因子诱导相比,共培养体系结合添加外源因子的诱导方法效果更好,这说明ESC在MenSC分化成子宫内膜上皮的过程中起到重要作用。

后续研究我们将主要聚焦在本实验所诱导形成的子宫内膜上皮细胞在修复受损伤的子宫内膜过程中起到的作用,为下一步治疗子宫内膜损伤提供理论依据。

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关键词
主题词
间充质干细胞
子宫内膜损伤
诱导分化
子宫内膜间质细胞