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脊柱外科
长链非编码RNA在人退变椎间盘组织中的基因表达谱
中华医学杂志, 2017,97(33): 2582-2586. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.33.006
摘要
目的

探讨长链非编码RNA(lncRNA)在椎间盘退变(IDD)的表达情况。

方法

应用人髓核(NP)组织的lncRNA-mRNA芯片。采用生物信息学方法来预测描绘差异性表达的lncRNA的功能及作用。并选择部分lncRNAs和mRNA用于定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)验证。

结果

在退变椎间盘组织中有差异性表达的总共1 570个lncRNA。其中,428个lncRNA的表达水平与正常椎间盘组织相比上调>2倍,而584个的表达水平下调。生物信息学分析(GO分析和KEGG生物学通路分析)显示,参与调节细胞外基质和凋亡的一些典型途径在这些细胞中异常表达(P<0.05)。分析增强子样的lncRNA及其附近的编码基因,确定3个lncRNAs为潜在的增强剂。RT-qPCR在退变髓核组织中验证了lncRNA的存在。

结论

lncRNAs参与椎间盘退变的进展。LncRNA可能是新的候选生物标志物和椎间盘退变潜在的治疗靶标。

引用本文: 孙中仪, 晏鹏, 王圣杰, 等.  长链非编码RNA在人退变椎间盘组织中的基因表达谱 [J]. 中华医学杂志,2017,97( 33 ): 2582-2586. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2017.33.006
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下腰痛严重影响人的生活质量并产生严重的社会经济负担[1]。下腰痛的主要原因是椎间盘退化(IDD)。研究表明,IDD的发生、发展过程中,涉及细胞的各个方面失调[2]。在这些改变的基础上存在特定分子基因表达的失调。大规模基因表达研究揭示,大量的编码基因在IDD中异常表达,其中部分编码基因这被证明在IDD中扮演重要角色[3];几种调节因子在不同层次的改变导致上述基因失调[4]。非编码RNA是不同组的哺乳动物基因组的转录输出,但是没有蛋白质编码功能。越来越多的证据表明非编码RNA参与协调基因表达的众多过程[5]。主要分为短链非编码RNA和长链非编码RNA(lncRNA)。lncRNA被证实在人类生物学方面发挥作用[6]。lncRNA表达失衡及突变与一系列人类疾病密切相关,包括神经变性和癌症[7]。然而,尚未见lncRNAs在IDD中表达谱的研究。本研究进行lncRNA-mRNA微阵列分析以鉴定IDD中髓核(NP)中lncRNA的表达谱,同时运用一系列生物信息学方法预测差异表达的lncRNA的功能。

对象与方法
一、方法
1.标本来源及分组:

本研究经医院伦理委员会批准,并获得患者同意。按照椎间盘退变Pfirrmann分级标准[8],将收集的髓核组织分为2组。实验组5例,病例纳入标准:患者有典型IDD临床症状和体征,并经腰椎MRI确认椎间盘发生退变。对照组5例,因外伤导致脊柱骨折,患者伤后到手术时间<48 h。病例纳入标准:患者术前MRI检查确认椎间盘无明显退变,伤前无腰腿痛等病史。排除标准:合并腰椎结核、椎间隙感染、脊柱肿瘤等;合并全身慢性消耗性疾病,肺结核、肺癌等;合并精神疾病及颅脑损伤,无法配合手术者;CT、MRI显示突出物钙化的腰椎间盘突出患者;严重营养不良及自身免疫性疾病患者;年龄>65岁的患者、有过腰椎手术史、腰部类固醇药物注射史者。

2.标本的处理:

所有纳入收集的髓核组织取出后,用生理盐水反复冲洗沾染的血液,在显微镜下仔细收集髓核组织存放在RNA later以备提取组织RNA。

二、方法
1.主要试剂和仪器设备:

Trizol试剂(invitrogen美国),逆转录试剂盒(Thermo美国),荧光定量试剂盒(Takara日本),PCR扩增仪(东胜国际贸易有限公司,中国),ABI7500实时定量PCR仪(Thermo美国),hiseq4000测序仪(Illumina美国)。

2.RNA提取和定量聚合酶链反应(PCR):

取实验组和对照组的髓核组织,在液氮中磨碎,采用Trizol试剂按常规方法提取髓核组织总RNA。髓核组织中lncRNA的表达通过Mx3000P仪器使用SYBR Premix ExTaq测量并使用以下循环参数:初始变性在95 ℃持续30 s,然后是95 ℃5 s,60 ℃持续40个循环20 s和95 ℃60 s,60 ℃30 s。引物是由中国Sangon Biotech公司设计。β肌动蛋白用作对照。实验一式三份进行,使用2-ΔΔCt法计算表达倍数变化[9]

3.lncRNAs测序:

使用lncRNAs测序进行分子测序。LncRNA研究领域最权威的数据库(覆盖RefSeq、UCSC Knowngenes、Ensembl、RNAdb、NRED、Fantom、misc_LncRNA等,以及众多LncRNA相关研究文献),相关LncRNA信息在纳入芯片载体前经仔细甄别,去除重复遗漏以保证芯片结果的有效可信。每个基因相对的转录本在芯片载体上都有特定的外显子探针或剪切接头探针作为代表,以保证在芯片结果中可以准确的鉴别每一个转录本。芯片上同时载有可以检测人属管家基因的阳性探针和阴性探针,以便于评估和控制芯片杂交试验的完成质量。

4.数据分析:

使用Agilent Feature Extraction软件分析采集的阵列图像。使用GeneSpring GX v11.5.1软件包进行分子标准化和随后的数据处理(Agilent Technologies)。通过倍数变化过滤鉴定差异表达的LncRNA和mRNA。使用Agilent GeneSpring GX软件(版本11.5.1)进行分层聚类。在标准富集计算方法中进行基因本体论(GO)和生物学通路分析。

5.统计学处理:

使用进行统计分析SPSS版本17.0软件(Chicago,美国)。结果表示为3次单独测定的±s。组间差异使用t检验(双尾)评估。P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1.差异表达的lncRNAs和mRNAs数据分析:

对于微阵列中的lncRNA表达值进行分层聚类分析(图1)。数据表明,与对照组相比,IDD中总共有1 570个lncRNA和4 157个mRNA有差异表达。其中,757个lncRNA上调,813个lncRNA下调,2 172个mRNA上调,1 985个mRNA下调。此外,152个lncRNA(84个上调和68个下调)和263个mRNA(156个上调和107个下调)以绝对倍数变化>5高度差异表达(表1)。

表1

在正常和退变椎间盘组织中差异表达的长链非编码RNA

表1

在正常和退变椎间盘组织中差异表达的长链非编码RNA

长链非编码RNA>2倍>5倍>10倍
上调4288426
下调5846819
图1
正常和退变椎间盘组织中RNA表达谱。分层聚类表示(A)lncRNA和(B)mRNA谱。(C)和(D)散点图是用于评估lncRNA和mRNA数据之间可视化的变化。红点代表相对高表达,蓝点代表相对低表达。lncRNA,长链非编码RNA。N1表示正常样品1,D1表示退化样品1,以此类推
图1
正常和退变椎间盘组织中RNA表达谱。分层聚类表示(A)lncRNA和(B)mRNA谱。(C)和(D)散点图是用于评估lncRNA和mRNA数据之间可视化的变化。红点代表相对高表达,蓝点代表相对低表达。lncRNA,长链非编码RNA。N1表示正常样品1,D1表示退化样品1,以此类推
2.GO分析:

上调转录物靶向的最高富集的GO是细胞代谢过程(GO:生物过程),细胞内组分(GO:细胞组分)和蛋白质结合(GO:分子功能),而下调的转录物(GO:生物过程),细胞外空间(GO:细胞组分)和蛋白质结合(GO:分子功能)。P值越低,则Goterm越显著(P值≤0.05)。325个基因与细胞外基质、细胞增殖和细胞凋亡有关(表2)。

表2

GO分析主要集中在细胞增殖、凋亡和细胞外基质

表2

GO分析主要集中在细胞增殖、凋亡和细胞外基质

GO.ID基因名称基因数量富集程度P
GO分析上调    
 GO:0006915apoptoticprocess1061.2503364270.000174419
 GO:0008283Extracellularmatrix781.1614517910.00654506
 GO:0006917induction ofapoptosis161.2524905910.040513474
GO分析下调    
 GO:0097190apoptotic signalingpathway52.7255131330.008043735
 GO:2001233regulation ofapoptotic signalingpathway92.8769641690.009633905
 GO:0008283Extracellular matrix691.4206665374.12154E-05
 GO:0042127regulation of cellproliferation421.4189396780.000335816
3.KEGG生物学通路分析:

生物学通路分析表明存在对应于上调转录物的63个生物学途径。过表达的mRNA靶向的高富集途径参与细胞周期、病毒致癌、转录失调等。相比之下,有75个生物学途径参与下调转录本。对应于下调的mRNA的重要途径与钙信号通路、MAPK信号通路及神经活性配体相关。

4.RT-qPCR验证:

使用2-ΔΔCt法计算表达倍数变化结果提示:与正常组相比,退变组中长链非编码RNA(HOTAIR、UCA1和BCYRN1)表达分别上调6.6、3.4和4.5倍,H19、MALAT1和NKILA表达分别下调0.6,0.7和0.5倍,与基因芯片分析的结果相符。

讨论

LncRNAs是一类长度超过200个核苷酸、具有调节基因表达作用的非编码RNA。LncRNAs参与了X染色体沉默、基因组印迹及染色体修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程,从表观遗传学、转录水平、转录后水平等多个方面调控基因表达。例如,LncRNA跨越下游蛋白编码基因启动子区域,直接干扰RNA聚合酶Ⅱ的聚集,从而抑制蛋白编码基因的表达;还可以募集染色质重塑促进特定基因位点的组蛋白修饰,进一步激活目标基因的转录;同时反义lncRNA可以与正义转录物重叠杂交,阻断剪接体对剪接位点的识别,从而导致可变剪接的转录物[10]。异常表达的lncRNAs已经在骨性关节炎中进行研究,并且干预lncRNA的表达与人类骨性关节炎的进展和预后性相关[11]。长链非编码RNA(HOTAIR、lncRNA-CIR、HOTTIP和H19)在骨性关节炎的发展和进展中起关键作用,主要与细胞外基质降解及合成相关[12,13,14,15]。然而,在人类椎间盘退变中还未见研究lncRNA的功能。通过微阵列数据分析发现大量的lncRNA和mRNA在退变的椎间盘中差异表达。随机选择的4个lncRNA行qRT-PCR的结果与微阵列数据匹配良好,证明了lncRNAs微阵列数据的高可信度。

首先,在正常和退变椎间盘中,本研究确定总共有1 570差异表达的lncRNAs。这些差异表达的lncRNA可能在IDD的发生和发展中起关键作用。进一步分析显示有428和584个lncRNA分别在5个退化样品中的至少4个中被上调和下调,与正常样品相比标准化的强度改变超过2倍。此外,为了深入了解差异表达转录本的生物学功能,本研究利用GO分析和KEGG生物学通路分析研究这些lncRNAs在椎间盘退变过程中的生物学功能。本研究发现325个基因与细胞凋亡和细胞外基质降解酶相关。在KEGG生物学通路分析中,63个生物学通路与上调的转录本相关。相比之下,有75个生物学通路与下调转录本相关。富集的生物学通路主要集中在细胞凋亡和细胞外基质酶,上述结果提示可能参与椎间盘退变的发生、发展过程。研究报道,椎间盘退变的机制与细胞外基质酶和细胞凋亡有关[16]。同时,课题组之前的研究表明NF-κB信号通路的异常激活参与椎间盘退变的发生、发展[17,18,19]。这些结果表明一些lncRNA可能通过调节细胞凋亡和细胞外基质酶在椎间盘退变过程中发挥关键作用。

据报道,某些具有特定特征的lncRNA可以分成几个亚组,例如Rinn lincRNA和增强子样的lncRNA。研究表明这些lncRNA的转录可以影响其附近的编码基因的表达,表达失衡的lncRNA与多种疾病密切相关[20]。KEGG生物学通路分析指示这些lncRNA与各种生物过程密切相关,例如细胞凋亡和磷酸化。髓核细胞的凋亡在IDD中起重要作用,主要是由Fas和Fas配体(FasL)相互作用诱导引起的。国外文献报道,在退变椎间盘组织中,Fas和FasL表达上调[21],FAF1是作为Fas死亡诱导信号复合物的成员的多结构域蛋白。FAF1的过表达可以显着增强Fas介导的凋亡和抑制泛素化蛋白的降解,导致细胞死亡增加。增强子样lncRNA可以激活近端启动子并刺激其附近编码基因的转录。利用增强子样lncRNAs可以抑制其邻近的蛋白质编码基因[20]。因此,lncRNAs可能通过调节附近的基因影响椎间盘退变的发生、发展过程。

此外,本研究选择一些研究的lncRNAs的表达以验证微阵列的一致性。Liu等[12]发现lncRNA-CIR在骨性关节炎的软骨细胞中表达显著增加,抑制lncRNA-CIR表达,促进Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖在骨性关节炎软骨细胞中的表达。HOTAIR在软骨细胞中也被证实,降低其表达有助于逆转IL-1β诱导的MMPs的表达,减轻动物模型中骨性关节炎的进展[13]。HOTTIP可以通过抑制HoxA-13 /整合素α1/ MMP-2信号通路促进软骨ECM的降解,其在OA的发病机制中起重要作用[14]。相反,在培养的人软骨细胞化学诱导缺氧条件下,H19和Col ⅡA1的表达(Col Ⅱ的亚型)显着增加,并且在H19和Col ⅡA1水平之间存在正相关性。这些发现表明H19具有保护作用,调节软骨细胞基质合成代谢和分解代谢之间的平衡[15],阻断lncRNA MALAT1也能够抑制肿瘤细胞外基质的合成[22]。这些研究结果表明lncRNAs可能参与椎间盘退变,并提供了新的靶点途径,以提高对分子机制的理解基础。然而,未来的研究需要充分阐明lncRNAs与椎间盘退变的机制。

总之,许多lncRNAs在正常和退变椎间盘组织中的差异表达,部分lncRNAs通过各种机制,包括调节细胞外基质和细胞凋亡在椎间盘退变中发挥重要作用。这表明lncRNAs可以通过与编码转录本和蛋白质的相互作用在椎间盘退变中发挥其功能。然而,lncRNAs的确切机制需要进一步研究并确定差异表达的lncRNA是否参与椎间盘退变的进展,应进行着重于lncRNA表达和功能的未来研究,以帮助患者延缓椎间盘退变。

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主题词
椎间盘
细胞衰老
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